（本文转载中华检验医学杂志，版权属于原作者）
中华检验医学杂志,,39(10):-.DOI:10./cma.j.issn.-..10..
摘要
静脉血栓栓塞症(VTE)是继冠心病和中风后排名第三的最常见的心血管疾病。在过去的年中，对于血液凝固过程及其调控机制的深入了解推进了VTE的诊断和治疗方法。年制定的魏尔肖三定律直今仍然是有效的，即VTE是由于血管壁受损、血液流动减慢和血液成分改变造成的。流行病学和临床科学现在也已经确定了VTE的多个后天获得性危险因素，如高龄、肿瘤、手术、外伤、固定、怀孕和使用口服避孕药等。随着遗传研究技术的快速发展，一些基因被确定与VTE的家族聚集性有关，与VTE相关的基因变异也逐渐被发现。遗传因素和后天获得性的危险因素在血栓的发展中相互作用。新型实验诊断项目能够帮助人们早期判断高凝状态。因此，为减少全球VTE负担，对VTE的预防，风险评估，诊断和治疗将更为重要。(中华检验医学杂志，,39：-)
血栓形成可以影响静脉循环中的任何分支[1]。最常见的表现是下肢或骨盆的深静脉血栓(deep-veinthrombosis，DVT)，以及其并发症——肺栓塞(pulmonaryembolism，PE)。静脉血栓栓塞症(venousthromboembolism，VTE)如今被认为是继冠心病和卒中后排名第3的最常见的心血管疾病。它在人群中的发病率是每千人0.75～2.69[2]。在公元13世纪，Mannucci和Poller报道了巴黎的外科医生HenriduPerchle发现第一例在腿部形成的静脉血栓[3]。这名患者是来自诺曼底的一名叫做拉乌尔的20岁男子，他由于单侧腿的肿胀而被怀疑形成了腿部深静脉血栓。
在VTE领域，已有大量的研究致力于发现VTE的危险因素[1]。其中一些危险因素很早就被确定。早在年一位外科军医RichardWiseman，描述了产后形成的静脉血栓，即产后血栓形成[3]。16世纪著名的法国外科医生AmbroiseParê，成为了第1个在静脉曲张并发症中描述浅表血栓的人[3]。19世纪ArmandTrousseau()开创性的首次记录了静脉血栓与癌症的关系[3]，这如今已被认为是VTE最重要的诱发条件之一。时下，一些VTE的后天危险因素也已被确定(癌症、妊娠和产后、口服避孕药、激素替代疗法、手术或外伤固定、腿麻痹、急性疾病住院、自身免疫性疾病、静脉曲张、老年、肥胖、既往VTE)[1,2]。在年著名的病理学家RudolfVirchow确立了魏尔肖三定律，指出血栓是由于血管壁受损、血液流动减慢和血液成分改变，使得形成血栓的趋势升高(高凝状态)导致的[3]。现在这一理论仍然是有效的。虽然VTE的后天危险因素很早就有论证，但它的遗传因素直到年才被报道[4]。现在大量的研究已着重于确定VTE的后天危险因素及遗传危险因素。Egeberg在年发现了遗传性抗凝血酶缺乏症[4]。而后在20世纪80年代对患者蛋白C或蛋白S缺陷的发现为5%～10%家族性血栓形成提供了遗传方面的解释。直到年Dahlb?ck发现了活化蛋白C抵抗，遗传因素是VTE的常见危险因素才得以明确[5]。现今由于遗传研究的技术进步，VTE相关的基因变异不断被发现，这些技术包括全基因组关联研究(genomewideassociationstudies，GWAS)和用于大规模DNA测序和鉴定的新技术[6]。
最初Hippocrates(约-B．C.)观察到动物血液在冷却时凝结[7]。尽管Hammarsten在年已经做出初步的阐释，但直到20世纪末凝血的瀑布理论及凝血相关酶学逐级反应才被确定下来[7]。年，Morawitz提出了抗凝血酶(antithrombin，AT)是负责血液凝固后凝血酶活性灭活的理论，直到年才在临床患者的血浆实验中得到证实[8]。年Stenflo分离并鉴定出了一种维生素K依赖性蛋白质——蛋白C，并很快证明活化的蛋白C(activatedproteinC，APC)能够与"自体凝血酶Ⅱa"结合并发挥作用。"自体凝血酶Ⅱa"是在20世纪60年代由底特律的Seegers等发现的抗凝血活性物质，在年由Marciniakto报告其是不同于凝血酶原的蛋白质[8]。凝血酶本身是蛋白质C的弱活化剂，由Owen和Esmon发现的血栓调节蛋白(thrombomodulin，TM)能够作为反应的辅因子，将凝血酶转换成具有抗凝活性，增强了对蛋白C系统的理解[8]。在蛋白C被报告后不久，DiScipio在血液中发现了另一种维生素K依赖性蛋白质，它被命名为蛋白S[8]。几年后，Walker证明了蛋白S是APC的辅因子。
年McLean发现了肝素，而后多伦多的Best和斯德哥尔摩的Jorpes对它进行了提纯，使它能够用于VTE的治疗[3,9,10]。同样重要的是年Schofield发现被华法林污染的干草能够引起牛出血，年Link因此纯化了香豆素[3,9]。一些凝血蛋白是依赖维生素K的。年Stenflo等描述了翻译后修饰的γ羧基谷氨酸结构域(γ-carboxyglutamicacid，GLA)，它只存在于维生素K依赖性蛋白质，解释了维生素K拮抗剂(香豆素)如何抗凝。近年来在凝血的研究领域开发出了几种新药，例如低分子肝素(lowmolecularweightheparin，LMWH)和新的口服抗凝血剂(neworalanticoagulants，NOAC)，它们使得VTE的治疗更加容易和安全，并且也都证实了在VTE预防上的可能性[3,9,10,11]。尽管如此，许多问题还没有解决，比如如何确定首次发生的无诱因VTE(即没有明确引起发病的危险因素)治疗时间的长短，因为抗凝治疗必然与增加的出血风险相平衡[12,13]。
静脉血栓栓塞的研究兴起比较晚，但是已得到越来越多的学者重视[14]。
一、凝血和抗凝血系统
为了了解VTE的病理生理原理，理解凝血和抗凝血系统是非常必要的[8]。在血管损伤部位，凝血系统被激活导致局部产生高浓度的凝血酶激活血小板和凝固血液(图1)。凝血级联的起始是由于血液组织因子(tissuefactor，TF)暴露。组织因子存在于血管外细胞，能够结合凝血酶原形式的因子Ⅶ(FⅦ)，也能结合活化后的因子Ⅶ(FⅦa)。组织因子的功能是作为丝氨酸蛋白酶FⅦa的辅因子，TF-FⅦa复合物激活因子Ⅸ(FⅨ)和因子Ⅹ(FⅩ)。这两个反应发生在带负电荷的磷脂膜的表面上，即活化暴露的血小板表面，其上的血液凝固蛋白结合并形成钙依赖性的酶活性复合物。因此，FⅨa结合其辅因子FⅧa形成tenase(FⅨa-FⅧa)复合物激活更多的FⅩ，而FⅩa与FⅤa形成凝血酶原(FⅩa-FⅤa)复合物使凝血酶原转化为凝血酶。在这些膜结合复合物中，FⅧa和FⅤa分别作为丝氨酸蛋白酶FⅨa和FⅩa的辅因子。没有这些辅因子，钙以及带负电荷的磷脂，FⅨa和FⅩa这两种酶的效率将是微不足道的。凝血酶通过转化循环前体FⅧ和FⅤ到他们的活性形式(FⅧa和FⅤa)正反馈激活凝血系统。
图1.血液凝固过程示意图
由于凝血系统能够放大启发刺激，所以如果没有有效控制，它会迅速地将循环血液转换成血栓[8]。因此凝血系统由许多的抗凝血机制进行调节，以确保凝血过程被限制在损伤部位。组织因子途径抑制剂(tissuefactorpathwayinhibitor，TFPI)是调节凝血的第一个起始。TFPI结合并抑制新形成的TF-FⅦa复合物关联FⅩa。然而，现今还没有关于TFPI遗传缺陷的报道。活化的凝血酶被循环丝氨酸蛋白酶抑制剂(serineproteaseinhibitor，serpin)之一的AT抑制。AT是一种多功能的丝氨酸蛋白酶抑制剂，能够抑制几乎所有的凝血途径酶(凝血酶、FⅦa、FⅨa、FⅩa、FⅪa和FⅫa)。AT本身抗凝血活性很有限，但在来自于内皮细胞表面的硫酸肝素(heparansulfate，HS)家族的糖胺多糖的辅助下，抗凝活性得到增强。在体内，AT的抑制活性定位于内皮细胞表面。肝素，是HS家族的一员，是AT活性的一个重要刺激成分，也是使用超过70年的最古老的抗凝药。肝素对AT的结合区域定位于一个戊糖(pentasaccharide)序列。根据这一原理已发明了包含这种特殊序列的新合成戊糖药物来刺激AT抗凝活性。
另一个控制机制是由两个辅因子FⅧa和FⅤa通过蛋白C(PC)调控的抗凝血系统。蛋白C是受凝血酶激活的维生素K依赖蛋白[8](图2)。凝血酶本身是蛋白C的弱激活剂。血栓调节蛋白(thrombomodulin，TM)存在于内皮细胞表面，凝血酶产生于完整的内皮以高亲和力与TM结合。凝血酶与TM的结合导致凝血酶的促凝血活性丧失，凝血酶激活后使C蛋白转化为活化蛋白C(activatedproteinC，APC)。TM在微循环中浓度最高，这对定位蛋白C活化和血液的自然抗凝十分重要。内皮细胞蛋白C受体(endothelialcellproteinCreceptor，EPCR)对于蛋白C的活化也很重要，EPCR有助于向凝血酶-TM复合物呈递蛋白C。在循环中产生的APC半衰期为20min。APC能够缓慢被蛋白C抑制剂(proteinCinhibitor，PCI)或者α-1抗胰蛋白酶抑制，APC与其辅因子蛋白S通过特异性裂解FⅧa和FⅤa的肽键来抑制凝血途径，这二者是凝血途径重要辅因子。蛋白S如同蛋白C一样也是重要的维生素K依赖性蛋白，蛋白S的另一个特征是它以两种形式存在于人的血浆中，游离蛋白S(30%～40%)，以及结合蛋白S，结合蛋白S是和补体C4b结合蛋白(C4b-bindingprotein，C4BP)形成的复合物。C4BP由7个相同α链和1个β链组成，每个α链结合1个补体C4b，β链结合蛋白S，链的分布形似章鱼状。游离蛋白S作为APC辅因子，而结合型蛋白S通过C4BP结合到带负电荷的膜磷脂，这可能是对补体系统激活重要的局部控制。
图2.蛋白C系统调节血液凝固过程示意图
APC介导的对FⅧa和的FⅤa的抑制，也发生在带负电荷的磷脂膜表面上[8]。FⅧa和FVa都对APC非常敏感，但在tenase复合物和凝血酶原酶复合物中，因为各自的酶FⅨa和FⅩa的结构在空间上阻碍了APC，FⅧa和FⅤa被部分保护。在FⅧa(R和R)和FⅤa(R、R和R)存在几个APC-切割位点。通过APC切割导致FⅧa和FⅤa分子裂解。APC的活性是通过蛋白S的刺激产生的，它们在带负电荷的磷脂表面上形成复合物。在APC对tenase复合物的调节中，蛋白S的APC辅因子活性由完整的FⅤ刺激产生。因此，FⅤ具有同时表达促凝和抗凝的潜力。
二、主要遗传血栓形成倾向
年Egeberg报道了一个存在杂合子AT缺陷的家族中有许多成员均患有VTE[8,15,16]。抗凝血酶遗传缺陷是罕见但强大的VTE危险因素。至今还没有报道过纯合子的AT缺陷。年，Griffin等描述了一个杂合子蛋白C缺陷家族中成员患VTE的病例。几年后，纯合子蛋白C缺陷被发现由于会导致微血管内广泛的血管内凝血，与严重的新生儿紫癜关联。从那以来，大量的蛋白C缺陷(Ⅰ型或Ⅱ型)已经报道，并且与蛋白C缺陷相关的基因也已经阐明。Ⅰ型缺陷为血浆蛋白质C浓度降低，而Ⅱ型缺陷有正常的蛋白C血浆浓度，但蛋白C功能活性降低。在血栓患者中，蛋白C缺陷比AT缺陷更常发现，但患者总数不到5%。在年，第一例蛋白S缺陷的VTE患者被Comp和Esmon等报道。Comp和Esmon发现，一些患者只有游离的蛋白S含量低，而C4BP绑定蛋白S(和总蛋白S)水平正常。这种模式被称为Ⅲ型蛋白S缺陷。在Ⅰ型蛋白S缺陷，无论是游离的还是总蛋白S水平均很低。而Ⅱ型蛋白S缺陷只在功能缺陷方面进行了少数病例的描述。Ⅰ型和Ⅲ型缺陷的差异多年来还不清楚，但20世纪90年代进行的家族研究显示某些家族的两型缺陷与相同的基因突变相关，这表明两种类型是相同的蛋白S基因突变。这两种类型的分子机制可以由蛋白S的摩尔浓度和血浆中C4BP的β链(C4BPβ＋)含量分析出来。在正常条件下，蛋白S的浓度超过C4BPβ＋约30%至40%。这两种蛋白质以非常高的亲和力相互结合，游离的蛋白S量是蛋白S超过C4BPβ＋浓度的摩尔量。轻度蛋白S缺乏表现为游离蛋白S不足，更严重的蛋白S缺乏则表现为结合蛋白S浓度降低，继而降低总蛋白S浓度。事实上蛋白S的游离形式具有更特异的抗凝功能，这也解释了为什么游离蛋白S测定对预测深静脉血栓形成的风险有较高的价值。
在20世纪80年代时期的一系列对血栓的研究中，即使20%～40%的血栓患者有阳性家族史，AT、蛋白C和蛋白S缺陷的患病率仍小于10%。这表明有更多的遗传危险因素尚未识别。年Dahlb?ck实验室在APC抵抗上取得了突破性的发现[5]。对血栓患者的血浆蛋白C样品的功能分析使得血栓内在机制的研究有了意外的收获。一个关键的观察结果是，在患者血浆中加入APC并没有导致预期的凝血时间延长。这种现象被称为APC抵抗(APCresistance)。进一步的研究表明，不论是在原发患者的家族中，还是有其他有血栓形成倾向的家族中，APC抵抗是具有遗传性的[17]。在后续的研究中发现，血栓患者中的APC抵抗是普遍存在的(20%～60%)，并且在健康人群中APC抵抗也比较常见(5%～10%)[8,15,16]。此外，混合血浆实验表明APC抵抗的机制在所有患者中是一致的。研究发现正常血浆蛋白提取物能够纠正APC抵抗，这为从分子机制确定和纯化参与APC抵抗的蛋白质供了一种手段[18]。Dahlb?ck的实验室对这种蛋白进行了纯化，年初Dahlb?ck和Hildebrand宣布其本质是FⅤ，表明APC抵抗由于FⅤ基因突变造成。很快一些实验室也报告发现了相同的FⅤ基因致病突变，在APC切割位点的位精氨酸被替换成谷氨酰胺，这使FⅤ能够不被APC灭活[8]。FⅤ突变通常被称为FⅤLeiden，这是因为来自荷兰莱顿的Bertina等首先报道了这种突变[19]。出乎意料的是，FⅤ突变不仅导致FⅤa也导致FⅧa的降解受损，其原因是完好的FⅤ对tenase复合物的调节依赖于APC对Arg的裂解。
FⅤLeiden在不同人群中的患病率差别很大，在健康人群中从缺失到高达10%～15%[8]。所有的FⅤLeiden患者有同样的FⅤ单倍基因型。Zivelin等估计此突变已经存在20年。因此，这发生在"出埃及记"后，这也解释了为什么FⅤ突变在白人中发现，而在远东亚洲，非洲黑人，以及美洲澳洲原住民极少或没有发现。这些人群中的FⅤLeiden突变缺失能够解释其较低的静脉血栓栓塞的发病率。
FⅤLeiden的杂合子增加了5倍的VTE风险，而纯合子则被认为会增加风险近50倍。FⅤLeiden突变最常见的临床表现是静脉血栓和肺栓塞，而并不是形成动脉血栓的重要危险因素。在某些人群的高发病率表明FⅤ突变有生存优势。研究表明FⅤLeiden突变使得分娩后严重出血风险减低，这对人类是有益的。另一方面FⅤLeiden增加的静脉血栓风险并不会给人类的生存带来强烈的负面影响，因为血栓近代才被发现，它不会影响人类繁衍。APC抵抗和致病FⅤLeiden突变被鉴定的几年后，来自莱顿的Poort等确定了另一个点突变作为静脉血栓栓塞的危险因素[20]。在这些病例中，突变的鉴定是基于血栓患者和对照组已知基因序列中对候选基因的识别来完成的。突变位于凝血酶原基因的3′非翻译区(核苷酸G→A)，因此不改变凝血酶原分子的结构。然而，突变与凝血酶原血浆水平的轻微升高相关，这导致了高凝状态和终身2～3倍的静脉血栓风险。同FⅤLeiden突变一样，这一突变的基本影响已经建立(突变存在近年)，凝血酶原突变发生率的变化取决于地理位置和种族背景。在欧洲南部健康人中。这一突变的发生率为2%～4%，是欧洲北部人群的两倍高。同FⅤLeiden突变一样，它在远东亚洲、非洲、澳洲和美洲的土著居民中罕见。在西方社会中，VTE患者中的突变率为6%～8%。
现今发现与VTE相关的基因变异名单正在迅速增长[6](表1)。最近的全基因组关联研究(GWAS)仍确定了几个新位点，虽然其中大多数变异对DVT风险影响较弱。值得一提的是，在ABO血型组，因为O型血组中FⅧ(和血管性血友病因子)浓度比那些非O型血群体浓度低，他们的VTE风险也随之降低。
三、易栓症是一种多病因疾病
静脉血栓栓塞的发病机制涉及环境和遗传危险因素，它已成为一个多因素疾病的一个典型的例子[21]。VTE是一个多病因疾病明显的体现在儿童患者中。在罕见的儿童血栓的事件中(0.7/000人年)，几个获得性和遗传性危险因素常常同时存在。因为许多遗传和/或获得性的危险因素在人群中常见，VTE在成年人也是多病因疾病。基因与基因的相互作用和基因与环境的相互作用可能同时发生。在人群中FⅤLeiden和凝血酶原A等位基因是常见的，很多人都有一个以上的遗传危险因素。相反，在低频率FⅤLeiden和凝血酶原A等位基因的国家里，很少有人携带多个基因缺陷。这可能解释了与欧美相比，中国和日本血栓栓塞性疾病的发病率较低的原因。带有两个或更多遗传缺陷的个体数目可以通过群体中遗传缺陷的发生率计算得出。假设FⅤLeiden的患病率为10%，蛋白C或蛋白S缺陷结合FⅤLeiden的个体发生预期在于(1～3)/00人，而凝血酶原和FⅤ突变的结合将在(1～2)/0人。因此，相当数量的人将属于有一个以上遗传缺陷的高风险组。
在有遗传缺陷的个体血栓的发生率是高度可变的，有些人永远也不会发生血栓，而有些人自幼经常性发生严重的血栓事件。这取决于特定的基因型，其他遗传缺陷的共存，以及环境危险因素，如口服避孕药、外伤、手术、妊娠的影响[21]。因此，带有杂合子FⅤLeiden也同时使用口服避孕药的妇女其血栓形成的风险将增加35～50倍，而那些纯合子的风险将增加几百倍。
四、讨论
在过去几十年中，我们对VTE的认识已经发生了巨大变化。得益于新技术的引进和新的理念，从早期临床观察罕见的遗传疾病患者开始，从简单的实验室检查，蛋白质化学或重组DNA技术，到基因重组、GWAS和全基因组测序。凝血和抗凝血系统的基础研究对了解静脉血栓栓塞症有关的病理生理有重要的意义，联合临床研究使我们能够发现新的治疗VTE方法，并对高危人群进行预防。然而，许多VTE的遗传因素仍是未知。虽然在VTE研究已经取得了巨大进展，但VTE仍将是一个重要的临床问题。很多时候，临床医生和患者对静脉血栓栓塞症状的发生仍然难以捉摸。对静脉血栓栓塞症的忽视，可能会导致致命的PE。在许多国家由于寿命延长、肥胖和久坐的生活方式，VTE发生率在增加。老年是VTE最强的危险因素之一，许多研究也已确定肥胖是VTE的重要危险因素。现代生活方式还与久坐相关，这也可以增加静脉血栓栓塞的风险，虽然流行病学证据中关于活动和静脉血栓栓塞风险尚有分歧。
五、未来的研究
在未来，更多的VTE遗传危险因素将被发现。为了确定VTE其余部分的遗传缺陷，已经提出了全基因组测序的策略[22]。新的遗传危险因素的识别可能为治疗甚至是预防遗传高危人群的VTE提供新的机遇。虽然许多新的用于治疗静脉血栓栓塞的高效药物如新型口服抗凝血药(noveloralanticoagulantdrugs，NOAC)已被开发，并且它们是传统的药物如香豆素良好的替代品，但其仍有增加出血的风险[23]。发展更安全的治疗和预防方案将是有益的。此外，发展更好的同时涉及遗传性和获得性高凝状态的临床风险评估模型也很重要性，一个重要的例子就是预测VTE复发[24]。
血凝学实验诊断学项目近年来发展很快，以往传统的使用ELISA方法检测的血凝学标志物，目前已有了电化学发光法检测，如凝血酶敏感蛋白TM(thrombomodulin),凝血酶抗凝血酶复合物TAT(thrombin-anti-Thrombin北京什么白癜风医院好北京白癜风哪里治疗最好
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