Circulation突破纳米粒子递

文献来源：Sun,Fei,etal."NanoparticleDeliveryofSTAT3AlleviatesPulmonaryHypertensioninaMouseModelofAlveolarCapillaryDysplasia."Circulation().PMID:

通讯作者

摘要

肺泡毛细血管发育不良伴肺静脉错位（ACDMPV）是一种罕见的由Foxf1基因位点突变导致下游STAT3的激活受到抑制，从而影响肺泡毛细血管内皮增殖的先天性疾病。肺动脉高压(Pulmonaryarteryhypertension,PAH或PH)是ACDMPV患者常见的并发症。医院的Kalinichenko教授团队证实了Foxf1突变体(Foxf1WT/S52F)小鼠出生后出现PAH和右心室（RV）肥大，且Foxf1WT/S52F小鼠的PH严重程度与死亡率、肺动脉肌肉化和肺组织胶原沉积增加直接相关。临床数据显示ACDMPV患者肺部纤维化重构增加。通过构建携带S52FFoxf1突变的小鼠胚胎干细胞(ESCs)嵌合体模型，证实了Foxf1WT/S52FESCs有向肺肌成纤维细胞分化的倾向。最后，血管内递送携带Stat3cDNA的纳米粒子可有效保护Foxf1WT/S52F小鼠免受RV肥大和PH的影响，改善生存率，减少肺纤维化重构。该研究证实了通过纳米粒子治疗来增加新生儿肺血管生成可能可以预防ACDMPV的PAH。

研究背景

科学问题：肺动脉高压是指肺小动脉增生性病变导致肺血管阻力进行性加重，进而右心衰竭并最终引起患者死亡的一组疾病。它既是一种疾病，又可以是其他疾病的一种表现。绝大多数ACDMPV病例会发生肺动脉高压，加重了呼吸功能不全和水肿，导致肺出血和广泛的肺重构。虽然肺泡毛细血管系统缺失会导致ACDMPV患者的PAH，但尚不清楚新生儿肺血管生成的增加是否可以防止PAH和右心室(RV)肥厚。

逻辑基础：1）Foxf1基因位点的杂合拷贝数变异缺失和点突变与ACDMPV有关(见往期推送)；2）绝大多数ACDMPV病例会发生肺动脉高压，加重了呼吸功能不全和水肿，导致肺出血和广泛的肺重构；3）S52FFoxf1突变(Foxf1WT/S52F)抑制Stat3信号传导并导致肺泡毛细血管发育不良，血管内纳米递送Stat3可以促进肺毛细内皮增殖，从而改善ACDMPV1。

科学假说：体内纳米递送Stat3可用于治疗S52Foxf1突变引起的肺动脉高压。

研究思路

结果解读

1.Foxf1WT/S52F小鼠出现肺动脉高压和右心室肥大既往研究表明，ACDMVP与肺动脉高压密切相关2。作者首先检测了ACDMPV模型成年鼠(Foxf1点突变/Foxf1WT/S52F)是否发生肺动脉高压。右心室导管检查(RVSP，诊断肺动脉高压的金标准)显示，比起WT(野生型)小鼠，Foxf1WT/S52F小鼠右心室收缩压显著增加。为了比较肺动脉血管阻力，作者采用超声心动图测量肺动脉加速时间(PAT，pulmonaryaccelerationtime)和肺动脉射血时间(PET，pulmonaryejectiontime)，计算PAT/PET比值(该比值是肺动脉血流和右心室功能的可靠指标)。结果显示，Foxf1WT/S52F小鼠的PAT/PET比值降低，表明与WT小鼠相比，Foxf1WT/S52F小鼠的动脉(PA)压力更高，右心室(RV)功能更差。此外，作者还评估了右心室壁厚度、右心室腔容量、三尖瓣环形平面收缩偏移(TAPSE)、每搏输出量、S波和心输出量(CO)等指标，均指示S52FFoxf1突变导致成年小鼠右心室肥厚和肺动脉高压。值得注意的是，Foxf1在肺组织中表达，但在心脏组织中不表达，提示是肺血管异常导致了Foxf1WT/S52F小鼠右心室肥大。肺动脉高压常与肺重构有关，而作者在Foxf1WT/S52F小鼠中的确观察到肺泡简化、毛细血管密度降低、小动脉肌肉化和肺动脉增厚等特征，提示Foxf1突变小鼠发生了肺纤维化重构。

2.Foxf1WT/S52F小鼠中的肺血管异常是右室肥厚的前兆

既往研究表明，Foxf1WT/S52F小鼠胚胎在出生前表现出ACDMVP，而肺动脉增厚发生在出生后3。为了确定Foxf1WT/S52F小鼠发生右心室肥大的时间，作者检测了Foxf1WT/S52F小鼠胚胎和幼年小鼠的心脏，发现在胚胎第17.5天(E17.5)，Foxf1WT/S52F小鼠心脏的右心室组织结构和心肌厚度等均正常。因此，S52FFoxf1突变在出生前不会导致右心室肥大。出生后，Foxf1WT/S52F小鼠的体重低于WT同窝小鼠，且经常在分笼前死亡。随后，作者根据4周龄时的体重和动脉氧合情况，将Foxf1WT/S52F小鼠分为L-Foxf1WT/S52F（动脉氧合降低，体重6g）和H-Foxf1WT/S52F（动脉氧合正常，体重＞6g）两组。形态与组织学结果显示，与WT和H-Foxf1WT/S52F同窝鼠相比，L-Foxf1WT/S52F小鼠的心脏更轻（下图未展示，见原文），心肌更厚，右心室心肌细胞体积更大。以上结果表明，Foxf1WT/S52F小鼠的右心室肥大发生在出生后，与死亡率、低体重和动脉氧合降低直接相关。

3.Foxf1WT/S52F小鼠右心室肥厚、肺泡毛细血管密度降低和动脉壁肌肉化直接相关

组织学检查显示4周龄Foxf1WT/S52F小鼠出现肺泡简化和肺气肿，且L-Foxf1WT/S52F组小鼠较H-Foxf1WT/S52F组更为严重。PECAM1和Endomucin(二者均为血管内皮标志物)免疫荧光染色结果显示，Foxf1WT/S52F两组小鼠均缺乏肺泡毛细血管网，而L-Foxf1WT/S52F小鼠的毛细血管密度下降更为严重。p-STAT3是内皮细胞增殖的关键转录调控因子，也是Foxf1的直接靶点。作者发现，与其他组相比，L-Foxf1WT/S52F小鼠肺内p-STAT3阳性的内皮细胞数量最少。既往研究发现，肺泡毛细血管发育不良会导致肺循环血压升高，导致肺动脉过度伸展和随后的动脉壁肌肉化1。本研究中作者也观察到上述现象。总而言之，毛细血管密度降低和肺动脉肌肉化与Foxf1WT/S52F幼鼠的动脉氧合降低、右心室肥大、低体重和死亡率直接相关。此外，在人ACDMPV肺部样本中也观察到大量肺泡和血管周围胶原沉积增加。综上，人和小鼠ACDMPV肺均表现出增加的纤维化重构(fibroticremodeling)，这也是血管重构的重要标志(血管重构是肺动脉高压的主要特征之一)。

4.S52FFoxf1突变促进胚胎干细胞分化为肺肌成纤维细胞

ACDMPV肺中过量的胶原沉积是由于PDGFRα+成纤维母细胞向αSMA+肌成纤维细胞的异常分化。作者使用αSMA和PDGFRα(CDa)免疫荧光染色来鉴定Foxf1WT/S52F和对照组肺中的肌成纤维细胞。结果发现，L-Foxf1WT/S52F小鼠肺泡区PDGFRα+肌纤维母细胞中αSMA+PDGFRα+肌纤维母细胞的比例增加。接下来，作者在体内测试了S52FFoxf1突变是否会加速胚胎干细胞(ESCs)向肺肌成纤维细胞的分化。作者使用包含S52FFoxf1突变和tdTomato谱系标记(tdT-S52FFoxf1ESCs)的ESCs（来自Foxf1WT/S52F;tdTomato转基因小鼠）。为了比较tdT-S52FFoxf1和GFP-WTESCs在体内分化为呼吸系统相关细胞谱系的能力，作者设计了囊胚注射嵌合体实验，即：将等量的tdT-S52FFoxf1和GFP-WTESCs注射到相同的WT囊胚中，再将嵌合胚胎移植到WT代孕母鼠的子宫中进行正常的胚胎发育。流式细胞分选（FACS）和免疫荧光染色分析显示tdT-S52FFoxf1和GFP-WTESCs均能均衡地分化为多种呼吸系统相关细胞类型，但tdT-S52FFoxf1ESCs对肺肌成纤维细胞的贡献要高于GFP-WTESCs。以上结果表明，在新生小鼠肺中，S52FFoxf1ESCs有分化为肺肌成纤维细胞的倾向；S52FFoxf1突变不影响ESC对其他呼吸系统相关细胞类型的分化。

5.在Foxf1WT/S52F小鼠中，纳米粒子递送Stat3cDNA可防止RV肥大并缓解肺动脉高压

既往研究已经证实了在早期新生鼠中，通过纳米粒子将Foxf1下游靶基因Stat3直接送入内皮细胞可增加Foxf1WT/S52F小鼠的肺泡毛细血管密度1。为了探究增加毛细密度能否保护L-Foxf1WT/S52F小鼠免受后期肺动脉高压的影响，作者将携带非整合CMV-Stat3表达载体或CMV空载体的PEI-MA5/PEGOA/Cho纳米粒子注射到P2（出生后2天）幼鼠的面静脉，并在P28时收取组织样本进行检测。与先前结果相似，纳米粒子递送的Stat3显著增加了肺部毛细血管密度、p-Stat3+内皮细胞数量，改善了Foxf1WT/S52F小鼠动脉氧合情况。随后，作者通过右心室导管检查和超声心动图等手段，确认了递送Stat3足以防止Foxf1WT/S52F小鼠的肺动脉高压和右心室肥大发生。

结论

在Foxf1WT/S52F小鼠中，通过纳米粒子递送Stat3增加肺泡毛细血管密度足以增加动脉氧合，防止肺动脉高压和右心室肥大，减少肺重构和提高生存率。

点评

该项研究证实了ACDMVP可以导致PAH和RV，并揭示了发病机制，同时提出了针对性的治疗方案，是一个比较好的从"临床疾病”——“发病机制”——“治疗方案”研究范例。该研究中同时也证实了纳米粒子作为基因治疗媒介在临床应用中的潜力。

思维发散

1.该项研究中揭示了S52FFoxf1突变(Foxf1WT/S52F)会导致ESCs更倾向于分化为肺成纤维细胞，背后机制是什么？

2.Foxf1在肺间质细胞（成纤维细胞）中也表达，那么其突变对间质细胞/成纤维细胞的影响是啥？会不会也是构成PAH的原因呢？

3.特异性靶向（肺）血管内皮的纳米粒子是否可能应用于治疗更多的临床（肺）血管疾病？

参考文献

1.Pradhan,Arun,etal."TheS52FFOXF1mutationinhibitsSTAT3signalingandcausesalveolarcapillarydysplasia."Americanjournalofrespiratoryandcriticalcaremedicine.8():-.

2.Bishop,NaomiB.,PawelStankiewicz,andRobinH.Steinhorn."Alveolarcapillarydysplasia."Americanjournalofrespiratoryandcriticalcaremedicine.2():-.

3.Pradhan,Arun,etal."TheS52FFOXF1mutationinhibitsSTAT3signalingandcausesalveolarcapillarydysplasia."Americanjournalofrespiratoryandcriticalcaremedicine.8():-.

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